应用改进的多聚组氨酸标签T7表达载体构建肺癌cDNA文库

应用噬菌体C端展示系统构建的cDNA文库缺乏开放阅读框筛选机制,文库中多数噬菌体克隆展示框外非天然短肽,给后期蛋白质的筛选带来了不便. 为实现噬菌体的ORF筛选功能,利用PCR技术对已有载体T7Select10-3b进行改造,在MCS处外源cDNA插入位点的3′端引入6聚组氨酸筛选标签,经包装后挑取成功表达的单克隆构建肺癌cDNA文库. 经镍柱亲和层析后,收集文库中表达组氨酸的克隆,利用化学发光免疫试验进行筛选效果鉴定. 结果显示,改造的新型载体可成功表达组氨酸标签,以此构建的肺癌cDNA文库经筛选后,含ORF插入的克隆由筛前的6 %提高至70 %,本研究为提高cDNA文库的质量提供了一种简便可行的方法.     

转基因低水平混杂问题——政策与内涵

转基因技术近年来在世界范围内快速发展,但由于不同国家在转基因审批上的不同步,以及各国设立严格的转基因低水平混杂阈值,导致正常的农产品贸易由于无意混入少量转基因成分而发生贸易摩擦,甚至导致贸易中断.从转基因低水平混杂(LLP)的含义出发分析其特殊性,分析了世界主要国家的LLP政策以及严格的LLP政策对贸易产生的负面影响.根据研究结果指出:在当前转基因作物采用率不断提高,以及转基因新品种研发加速背景下,转基因低水平混杂在技术上是不可避免的.因此,有必要在全球范围内建立转基因安全互信机制,各国需要尽量减少审批不同步时滞,设置合理的转基因低水平阈值,降低对正常贸易的负面影响.研究结果对中国转基因LLP政策和有关标准制定有一定借鉴意义.     

单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体的制备与鉴定

以单核细胞增生李斯特菌细胞碎片免疫BALB/c小鼠,间接ELISA法成功筛选获得2株稳定分泌抗LM的单克隆杂交瘤细胞株4A7、4H11.抗体效价为1∶160 000以及1∶20 000,亚型为IgG1、IgG2a,Dot-ELISA结果表明4A7和4H11单克隆抗体具有很好的属特异性,Western blot分析表明4A7、4H11抗体分别与单核细胞增生李斯特菌62 kDa以及32 kDa外膜蛋白抗原表位结合,胶体金免疫电镜实验进一步确证以上抗体可有效识别单核细胞增生李斯特菌细胞表面抗原.     

高糖和bFGF对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的：骨组织的形成是一个复杂的过程,受多种因素的影响,糖尿病所导致的持续高血糖对于成骨分化的影响机制尚不明确,以及在此分化过程中的各种细胞因子的作用机理仍不明了,现拟通过体外成骨诱导环境,观察高糖和碱性成纤维细胞生长因子（fibroblastgrowthfactorbFGF）对人骨髓间充质干细胞（humanmesenchymalstemcellshMSCs）成骨分化的影响。方法：hMSC在5．5mmol／L和25mmol／L葡萄糖浓度下培养6天,使用cck一8法测定各组细胞增殖情况;hMSC在两种糖浓度下成骨诱导28天,通过碱性磷酸酶（ALP）活性检测、茜素红染色、钙结节半定量检测,对比各组成骨分化活性;在两种糖浓度成骨诱导液中加入10ng／mlbFGF,使用RT—PCR技术检测各组细胞OCN、OPNmRNA表达差异。结果：高糖较正常糖浓度细胞增殖率下降,ALP活性降低,茜素红染色钙结节量减少,RT—PCR检测结果显示25mmol／L组OCN、OPNmRNA表达量低于5．5mmol／L组,加入bFGF后,25mmol／L组仍低于5．5mmol／L组,与未添加bFGF同葡萄糖组比较表达增加。结论：高糖使hMSC增殖能力下降,在成骨分化的过程中ALP活性降低,成骨相关基因OCN、OPN表达量下降,证明了高糖对hMSC成骨分化具有抑制作用,当加入bFGF后,改善了高糖对hMSC的抑制作用,提示糖尿病条件下高糖的存在是导致hMSC成骨分化能力下降的不利因素,同时初步证明了bFGF参与了成骨分化的过程,从而为在分子水平探讨糖尿病患者种植义齿骨结合形成相关机制奠定初步的基础．．     

腹腔镜胆囊切除术治疗高龄患者急性胆囊炎的临床观察

目的：探讨腹腔镜胆囊切除术治疗高龄患者急性胆囊炎的应用价值。方法：回顾性分析2005年1月．2011年12月我院收治的210例65岁以上因急性胆囊炎实施胆囊切除术的老年患者的临床资料,按手术方式分为腹腔镜组（LC组）和剖腹胆囊切除术组（OC组）,分析和比较两组患者的手术时间、术后肠功能恢复时间及住院时间,术中出血、腹腔引流量和术后并发症的发生情况。结果：与OC组比较,LC组的手术时间、术后肠功能恢复时间及住院时间均显著缩短,差异有统计学意义（P〈0．01）;但两组之间术中出血、腹腔引流量和术后并发症的发生率差异均无统计学意义（P〉0．05）。LC组中转开腹10例,占7_35％;其中粘连严重导致胆囊三角解剖不清6例,无法控制的出血2例,结石嵌顿胆囊管2例。结论：老年急性胆囊炎患者在条件合适的情况下行腹腔镜胆囊切除术治疗有助于患者更快地恢复．具有较强的临床应用价值。     

HIF-1α和VEGF—c在胃癌组织中的表达及临床意义研究

目的：探讨HIF-1α和VEGF—c在胃癌组织中的表达情况及临床病理意义。方法：选取2010年12月至2012年12月期间就诊于我院肿瘤外科需进行手术切除的胃癌标本及其配对的癌旁组织各73例进行研究分析,采用免疫组化SP（streptavidin perotridase）对胃癌组织以及癌旁组织中HIF-1α和VEGF-c的表达情况进行检测。结果：①HIF-1α和VEGF-c在癌旁组织几乎不表达,而在胃癌组织中的阳性表达率分别为83．56％、78．08％,显著高于癌旁组织,经分析,差异具有统计学意义（P〈0．05）;②HIF—hx和VEGF-c的阳性表达和浸润深度、淋巴结转移以及临床分期密切相关,差异具有统计学意义（P〈0．05）;③HIF-1α和VEGF-c在胃癌组织中的表达存在一定的相关性（r=0．654,P〈0．05）。结论：HIF．hx和VEGF-c的阳性表达可以作为胃癌侵袭转移的重要判定指标,这对于本病的临床治疗具有一定的指导性意义。     

布地奈德混悬液雾化吸入治疗小儿急性喉炎的临床观察

目的：观察布地奈德混悬液雾化吸入治疗小儿急性喉炎的临床疗效。方法：选择2010年6月~2012年12月我院收治的急性喉炎患儿67例为研究对象,并将其随机分为对照组和观察组,两组均给予相同的综合性治疗。在此基础上,对照组仅通过静脉给予地塞米松,观察组在地塞米松静脉给药的同时,加用布地奈德混悬液雾化吸入治疗。治疗后,观察和比较两组患儿的症状、体征缓解时间及住院时间。结果：观察组声音嘶哑、犬吠样咳嗽、喉喘呜、吸气性呼吸困难的缓解时间及住院时间均明显短于对照组,观察组雾化吸入布地奈德4h、24h时的临床疗效明显优于对照组,差异有统计学意义（P〈0．05）,两组均无不良反应的发生。结论：布地奈德混悬液雾化吸入治疗小儿急性喉炎起效快,病程短,方法简单,不良反应少。     

马铃薯立枯丝核菌拮抗菌QHZ11的实时荧光定量PCR快速检测与应用

【背景】植物根际促生菌(plant growth-promoting rhizobacteria,PGPR)在根际的定殖是其发挥作用的基础,直观有效的跟踪技术和定量方法是研究PGPR在根际原位分布规律的重要工具。【目的】建立一种马铃薯黑痣病病原菌——立枯丝核菌拮抗菌QHZ11的实时荧光定量PCR快速检测体系,并检测拮抗菌QHZ11在马铃薯根际的动态变化。【方法】根据GenBank中登录的类芽孢杆菌及近源菌株gyrB基因序列差异筛选特异性引物,优化反应条件;通过盆栽试验对马铃薯根际拮抗菌进行快速检测。盆栽试验设3个处理,T1：对照(无菌水,CK);T2：QHZ11菌悬液灌土(QHZ11);T3：将功能菌在有机肥中进行二次固体发酵制成生物有机肥(BOF11)。【结果】筛选出拮抗菌QHZ11的专用引物为gyrB-F/gyrB-R;建立的拮抗菌QHZ11实时荧光定量PCR检测方法特异性好、灵敏度高且重复性较好,线性相关系数为0.999 8,检测组内变异系数均在1%以内,扩增效率为0.9,可检测出1×103?1×1010 copies/g-soil的拮抗菌,具有检出限低和扩增效率高的特点。盆栽试验结果发现,T3处理马铃薯根际拮抗菌QHZ11的数量从接种的第10天即高出T2处理一个数量级,并于马铃薯盛花期(接种后第60天)达到峰值,说明二次固体发酵增加了拮抗菌在根际土壤中的存活和繁殖。【结论】建立的实时荧光定量PCR快速检测体系灵敏、高效,可为研究拮抗菌在马铃薯根际原位分布以及与病原菌的互作方面提供便捷有效的方法。     

猪流行性腹泻病毒经其附属蛋白抑制细胞凋亡

【背景】orf3位于猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV) s基因与e基因之间,是目前发现的PEDV唯一一个附属基因,编码附属蛋白(ORF3蛋白)。我们前期研究初步发现ORF3蛋白对PEDV诱导的细胞凋亡有影响。【目的】研究ORF3蛋白在PEDV侵染复制过程中的毒力作用机制。【方法】实验用3种PEDV:rDR13att-?ORF3 (orf3基因全部敲除)、DR13-ORF3att (携带有C端截短orf3)、rDR13att-ORF3wt(携带全长orf3基因)感染Vero细胞,观察病变情况,再用活细胞成像仪、流式细胞仪、 DNA断裂的原位末端标记法[terminaldeoxynucleotidyltransferase(TDT)-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL]等方法检测不同感染时间点的细胞凋亡情况,然后用蛋白质印迹方法分析PEDV感染宿主细胞中主要凋亡相关蛋白(如Caspase-3)的活化或裂解,最后进行转录组测序研究病毒感染细胞中差异基因的表达情况,再用荧光定量PCR验证转录组结果。【结果】rDR13att-?ORF3引起较多的细胞病变,活细胞成像仪的动态观察结果显示,3种病毒侵染的细胞凋亡水平随着时间的延长均高于正常阴性细胞,但敲除orf3的病毒感染细胞后细胞凋亡率比其他两种病毒更高;敲除orf3病毒感染细胞凋亡率显著高于其他两种病毒;病毒rDR13att-?ORF3感染细胞后TUNEL阳性细胞数比DR13-ORF3att和rDR13att-ORF3wt更多;表达ORF3蛋白的重组PEDV可以抑制Caspase-3的活化;ORF3蛋白对受感染细胞Heat shock 70 kD protein 1B (HSP70)基因转录有促进作用,荧光定量PCR结果表明rDR13att-ORF3wt感染细胞的HSP70表达量高于rDR13att-?ORF3感染细胞。【结论】PEDV通过ORF3蛋白抑制细胞凋亡,而且这种作用可能是通过抑制Caspase-3的活化或增加HSP70的产生来完成的。     

基于红外相机技术对佛坪国家级自然保护区 大熊猫季节性空间分布与活动模式的研究

2015年1月至2017年12月,在陕西佛坪国家级自然保护区海拔1 200~2 500 m的57条大熊猫(Ailuropodamelanoleuca)活动频繁的巡护样线上,布设130台红外相机。累计红外相机有效工作日100 685 d,共拍摄到大熊猫有效独立照片1 831张。将红外相机拍摄的有效照片和相机工作日依据不同竹种类型及保护站归类,对大熊猫季节性空间分布与活动模式进行研究。结果表明:(1)大熊猫春季活动最为频繁,在巴山木竹(Bashania fargesii)林和秦岭箭竹(Fargesia qinlingensis)林中相对多度分别是2.89和3.72;其次是冬季,在巴山木竹林和秦岭箭竹林中的相对多度分别是2.95和2.74。3月份是其活动高峰,巴山木竹林和秦岭箭竹林中的相对多度指数都是最高;11、12和1月份,大熊猫在巴山木竹林中相对多度指数高于秦岭箭竹林;2至10月份,大熊猫在秦岭箭竹林中的相对多度指数都要高于巴山木竹林。(2)大熊猫在佛坪保护区各个保护站均有分布,且存在季节性空间分布差异。三官庙和西河保护站全年的12个月都能够捕获到大熊猫的身影,是大熊猫分布相对多度最高的两个区域,大古坪、岳坝和龙潭子3个保护站海拔较低,大熊猫主要集中在冬春季节活动;凉风垭保护站海拔较高,主要分布的是秦岭箭竹林,大熊猫主要在夏季活动。(3)干扰活动主要包括采集、放牧、旅游、家犬活动和监测5种类型。干扰活动类型在各个保护站存在差异,且多为零星干扰,对大熊猫的活动和分布存在一定影响。本研究较为全面地调查了佛坪国家级自然保护区大熊猫季节性活动动态和区域性分布状况,调查结果可为后期的保护管理提供有效的参考依据。